查看: 1098|回复: 7

[转录组] 植物也能做高通量单细胞测序

[复制链接]
  • TA的每日心情

    昨天 09:59
  • 签到天数: 80 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    管理员

    Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

    主题
    202
    奥币
    807
    积分
    3286
    注册时间
    2018.4.19
    在线时间
    562 小时

    推广达人宣传达人活跃会员


    发表于 2019.3.15 09:27:06 | 显示全部楼层 |阅读模式
    单细胞转录组测序能在单个细胞分辨率下研究转录组表达情况,完美解决细胞异质性问题。由于细胞壁等因素的限制,植物的单细胞研究要稍晚于动物领域,目前植物单细胞文章主要是针对少量单细胞转录组异质性的研究,高通量水平还未应用到植物领域。

    2019年2月4日,就在中国人民喜迎除夕之际,美国密歇根大学John Schiefelbein实验室在线发表了拟南芥高通量单细胞转录组(scRNA)研究文章,发表杂志为Plant Physiology(IF=5.949),这也是第一篇将10x Genomics scRNA测序应用在植物中的发表文献。



    材料与方法
    1.取发芽5d野生型拟南芥(Columbia ecotype)根尖组织,3个生物学重复,约100,000个原生质体进行10x Genomics scRNA-seq分析。


    图1野生型拟南芥单细胞转录组测序流程

    2.rhd6(根毛细胞缺陷)和gl2(非毛细胞缺陷)两种拟南芥突变体根组织也进行了10x Genomics scRNA-seq分析。

    研究结果

    1野生型拟南芥根尖组织细胞图谱

    分析结果显示,平均每个细胞获得~75,000reads、~5,000个表达基因,共检测到超过22,000个基因。细胞聚类分群得到9个主要的细胞亚群,3个样本重复间也显示出较高的可重复性;同时利用已知标记基因注释各个细胞亚群类型。


    图2  野生型拟南芥根尖细胞分群结果

    2根表皮组织分析

    进一步分析表皮组织数据,研究根毛细胞和非毛细胞的分化。将表皮组织和根冠组织细胞重新聚类,得到11个细胞亚群,分别注释为根毛细胞(亚群1,2,3)、非毛细胞(亚群8,9,10)、小柱根冠细胞、侧根冠细胞和分生细胞(亚群7)。

    拟时分析结果暗示,亚群7中可能包含分生细胞,能分化成两个方向--根毛细胞和非毛细胞;基因表达分析证实,亚群7存在部分细胞,可能是表皮细胞系的起源。


    图3  根毛细胞和非毛细胞分群与拟时分析

    3拟南芥突变体根组织细胞图谱

    rhd6(根毛细胞缺陷)和gl2(非毛细胞缺陷)突变体细胞分群结果显示,相较于野生型拟南芥,rhd6根毛细胞比例显著减少,而gl2突变体非毛细胞的比例也显著减少;且大多数标记基因未表达。以上结果表明,scRNA-seq能在单细胞分辨率下有效定义植物细胞亚群,研究突变体特征。

    实验步骤

    植物10x Genomics scRNA-seq一个很大的限制因素是无法获得高活力的原生质体,下面给出了上述文献中拟南芥根组织原生质体的制备流程,供参考,实际操作时需要根据研究的组织类型,对实验条件进行优化,例如解离酶的选择、解离酶的处理时间等。

    1溶液准备

    清洗液:0.4 mM 甘露醇(Mannitol)、20mM MES (pH 5.7)、20 mM KCl、10mM CaCl2、0.1% (w/v) BSA;
    酶解液:1.25% (w/v) 纤维素酶Cellulase("ONOZUKA" R-10, Yakult)、0.1% (w/v)果胶酶Pectolyase (P-3026, Sigma-Aldrich)、0.4 mM Mannitol、20mM MES (pH 5.7)、20 mM KCl、10mM CaCl2、0.1% (w/v) BSA。

    2原生质体悬液制备

    1)  取拟南芥根尖,切碎,70-μm滤器过滤;2)  置于35 mm培养皿中,加入酶解液;3)  放入恒温摇床(85 rpm),25°C酶解1h;4)  500 g 离心10 min;5)  离心,加入500 μL清洗液洗涤;6)  40μm细胞滤器过滤原生质体悬液后,200g离心 6 min;7)  清洗液重悬,确定原生质体浓度,冰上放置,可进行10x上机标记。
    注:这篇文献的参考方法是10x官网给出的苔藓原生质体的操作步骤,优化了溶液体系,苔藓原生质体操作步骤可点击链接下载查看
    https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/tRjkzNZ8LQsGYM2cyGK4g/6afcd76f0a198835e19df7041381c748/CG000090_SamplePrepDemonstratedProtocol_-_Moss_Protoplasts_RevC.pdf

    Tips
    基迪奥提供丰富的10xGenomics 单细胞测序服务,包括 5’端和3’端基因表达谱分析、单细胞免疫组库分析(T/B细胞)及10x单细胞ATAC-seq分析。对10x单细胞测序感兴趣的老师和同学可留言咨询,基迪奥生物有丰富的项目经验,提供专业的解决方案和一对一的个性化分析服务,技术团队会携带仪器上门服务!

    参考文献
    Ryu K H, Huang L, Kang H M, et al.Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individualplant cells[J]. Plant physiology, 2019: pp. 01482.2018.

    本文作者:基迪奥李白

    本帖子中包含更多资源

    您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

    x
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    昨天 09:59
  • 签到天数: 80 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    管理员

    Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

    主题
    202
    奥币
    807
    积分
    3286
    注册时间
    2018.4.19
    在线时间
    562 小时

    推广达人宣传达人活跃会员


     楼主| 发表于 2019.3.15 10:02:35 | 显示全部楼层
    拟南芥已经来了,其他物种还会远吗
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    害羞
    昨天 10:07
  • 签到天数: 482 天

    连续签到: 38 天

    [LV.9]以坛为家II

    迅猛龙

    Rank: 8Rank: 8

    主题
    24
    奥币
    3055
    积分
    1466
    注册时间
    2016.1.8
    在线时间
    328 小时

    发表于 2019.3.15 10:52:38 | 显示全部楼层
    每天一赞 666
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    2019.3.15 14:20
  • 签到天数: 4 天

    连续签到: 1 天

    [LV.2]偶尔看看I

    草履虫

    Rank: 2

    主题
    0
    奥币
    66
    积分
    9
    注册时间
    2018.11.15
    在线时间
    3 小时

    发表于 2019.3.15 14:31:59 | 显示全部楼层
    赞一个拟南芥已经来了,其他物种还会远吗?
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情

    昨天 09:59
  • 签到天数: 80 天

    连续签到: 1 天

    [LV.6]常住居民II

    管理员

    Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15Rank: 15

    主题
    202
    奥币
    807
    积分
    3286
    注册时间
    2018.4.19
    在线时间
    562 小时

    推广达人宣传达人活跃会员


     楼主| 发表于 2019.3.15 15:37:13 | 显示全部楼层
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

    该用户从未签到

    草履虫

    Rank: 2

    主题
    0
    奥币
    32
    积分
    22
    注册时间
    2019.3.16
    在线时间
    0 小时

    发表于 2019.3.16 11:49:50 | 显示全部楼层
    这就厉害了
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    忙~
    昨天 08:55
  • 签到天数: 751 天

    连续签到: 3 天

    [LV.10]以坛为家III

    中华鲟

    Rank: 5Rank: 5

    主题
    0
    奥币
    2793
    积分
    789
    注册时间
    2016.4.8
    在线时间
    498 小时

    发表于 2019.3.18 16:04:14 | 显示全部楼层
    其他植物在不远的将来
    战拖
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    忙~
    昨天 13:00
  • 签到天数: 7 天

    连续签到: 2 天

    [LV.3]偶尔看看II

    草履虫

    Rank: 2

    主题
    0
    奥币
    42
    积分
    18
    注册时间
    2018.12.19
    在线时间
    4 小时

    发表于 7 天前 | 显示全部楼层
    感觉这个平台真的太棒了!
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

    您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

    本版积分规则

    快速回复 返回顶部 返回列表